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La Lettre
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Marquage cellulaire
Le marquage cellulaire par fluorescence est bien plus ancien que l’utilisation
des biopuces, puisque les premiers essais datent de près d’un siècle, avec le
marquage de bactéries et de protozoaires. Des fluorochromes ont ensuite été
développés pour marquer spécifiquement des organites cellulaires
in vitro :
noyau, mitochondries, lysosome, membranes ou, encore, récepteurs.
Ce type d’étude a notamment bénéficié du développement de la microscopie
confocale. Avec cette technique, le plan focal de l’objectif est positionné
à différents niveaux de profondeur dans l’échantillon, donnant des séries
d’images à partir desquelles on obtient une représentation tridimensionnelle
de l’objet, comme une cellule. Cette technique permet également des
études de colocalisation. À titre d’exemple, elle a été utilisée pour sonder le
mécanisme d’action, au sein d’un monocyte, d’un dendrimère (macromolécule
hyperramifiée) candidat médicament, marqué par la fluorescéine
3
. Les images
de microscopie confocale montrent une colocalisation de la fluorescence verte
du dendrimère avec celle rouge des phagolysosomes, mais pas avec la fluorescence bleue de l’ADN. On
peut donc en déduire que ce dendrimère suit principalement la route phagolysosomiale pour entrer dans
le monocyte, et qu’il ne pénètre pas dans le noyau.
Pour connaître précisément la localisation de l’entité marquée que l’on souhaite suivre, on peut utiliser
le phénomène de FRET. Dans le cas du dendrimère précédent, un marqueur spécifique de récepteurs
cellulaires - la phycoérythrine, une protéine, couplée à un anticorpsmonoclonal -, dont la bande d’absorption
recouvre presque intégralement la bande d’émission de la fluorescéine, a été utilisé pour déterminer à
proximité de quel récepteur se trouvait le dendrimère
3
. Le FRET est aussi un outil très puissant pour
quantifier les interactions protéines-protéines ou protéines-ADN, les changements de conformation des
protéines, ou pour obtenir des informations sur les voies métaboliques.
Perspectives de la fluorescence en imagerie
À côté des fluorochromes issus de la chimie organique
(
voir supra
), d’autres types de fluorochromes sont
aussi utilisés aujourd’hui, en particulier les protéines
fluorescentes comme la GFP (
green fluorescent
protein
), issue d’une méduse du Pacifique. La GFP
permet notamment d’étudier les phénomènes dyna-
miques prenant place dans des cellules ou des tissus
vivants. Cependant, les fluorochromes organiques
subissent des phénomènes de photoblanchiment
(oxydation par l’oxygène, voire destruction du fluoro-
chrome, qui éteint la fluorescence).
Étude de colocalisation par
marquage cellulaire fluorescent
et microscopie confocale
L’ADN (noyau) d’un monocyte humain
est marqué par un fluorochrome bleu
(TOTO-3, dimère de carbocyanine) et
ses vésicules internes acides (phago-
lysosomes) par un fluorochrome rouge
(LysoTracker®, dérivé de bodipy). Le
dendrimère-candidat
médicament,
quant à lui, apparaît en vert (lié à la
fluorescéine)